Окисли́тельное фосфорили́рование — метаболический путь, при котором энергия, образовавшаяся при окислении питательных веществ, запасается в митохондриях клеток в виде АТФ. Хотя различные формы жизни на Земле используют разные питательные вещества, АТФ является универсальным соединением, в котором запасается энергия, необходимая для других метаболических процессов. Почти все аэробные организмы осуществляют окислительное фосфорилирование. Вероятно, широкому распространению этого метаболического пути способствовала его высокая энергетическая эффективность по сравнению с анаэробным брожением.
При окислительном фосфорилировании происходит перенос электронов от соединений-доноров к соединениям-акцепторам в ходе окислительно-восстановительных реакций. В ходе этих реакций выделяется энергия, которая далее запасается в виде АТФ. У эукариот эти окислительно-восстановительные реакции осуществляются несколькими белковыми комплексами, локализованными во внутренней митохондриальной мембране, а у прокариот они располагаются в межмембранном пространстве[en] клетки. Этот набор связанных белков составляет электрон-транспортную цепь (ЭТЦ). У эукариот в состав ЭТЦ входит пять белковых комплексов, в то время как у прокариот её составляют множество различных белков, работающих с различными донорами и акцепторами электронов.
Энергия, выделяющаяся при движении электронов по ЭТЦ, используется для перекачки протонов из митохондриального матрикса через внутреннюю мембрану в межмембранное пространство. При этом увеличивается электрохимический градиент, то есть возрастает разность концентраций протонов и разность электрических потенциалов по обе стороны внутренней мембраны, и тем самым накапливается энергия, которая высвобождается при возвращении протонов в матрикс. Обратно в матрикс протоны проходят через особый белковый комплекс — АТФ-синтазу; сам процесс перемещения протонов по их электрохимическому градиенту получил название хемиосмос. АТФ-синтаза использует выделяющуюся при хемиосмосе энергию для синтеза АТФ из АДФ в реакции фосфорилирования. Эта реакция запускается при вращении части АТФ-синтазы, которое поддерживается благодаря потоку протонов: таким образом, АТФ-синтаза работает как вращающийся молекулярный мотор.
Хотя окислительное фосфорилирование обеспечивает энергией клетки и поддерживает жизнь клеток, в ходе этого процесса также образуются активные формы кислорода, в частности, супероксид и пероксид водорода. Они способствуют образованию в клетках свободных радикалов, которые разрушают белки и причиняют вред клеткам, приводя к болезням и старению. Ферменты окислительного фосфорилирования являются мишенями для многих биологически активных веществ и ядов, которые подавляют их активность.
Окислительное фосфорилирование следует отличать от субстратного фосфорилирования, при котором АТФ синтезируется не за счёт энергии переноса электронов и протонов по цепи переносчиков, а при фосфорилировании АДФ до АТФ при отрыве фосфата от соединений с высоким потенциалом переноса фосфата.
Механизм окислительного фосфорилирования основан на использовании реакций, в ходе которых энергия высвобождается (экзергонических), для проведения реакций, которые протекают с затратой энергии (эндергонических). Переход электронов по электрон-транспортной цепи от доноров электронов (например, НАДН) к акцепторам (например, кислороду) является экзергоническим процессом: в ходе него выделяется энергия. Напротив, синтез АТФ — эндергонический процесс, для него необходим приток энергии. Белковые комплексы ЭТЦ и АТФ-синтаза располагаются в мембране, и энергия переносится от ЭТЦ к АТФ-синтазе опосредованно благодаря переносу протонов через мембрану в ходе хемиосмоса[2]. По сути, этот механизм напоминает электрическую цепь, в которой протоны переносятся с отрицательно заряженной стороны мембраны (N-сторона) на положительно заряженную под действием ферментов ЭТЦ, выполняющих роль источника тока и функционирующих как протонные помпы, а АТФ-синтаза выполняет роль полезной нагрузки в цепи. Ферменты ЭТЦ могут быть образно описаны как батарейка, поддерживающая электрический ток в цепи и вращающая моторчик АТФ-синтазы, штампующий молекулы АТФ. Перекачка протонов через мембрану создаёт электрохимический градиент, который часто также называют протонодвижущей силой. Этот градиент слагается из двух составляющих: разницы в концентрации протонов (Н+-градиент, ΔpH) и разности электрических потенциалов, причём N-сторона заряжена отрицательно.
Запасённая при переносе протонов энергия используется для работы АТФ-синтазы. Протоны перемещаются по электрохимическому градиенту обратно на N-сторону мембраны, запуская вращение некоторых частей молекулы фермента. Благодаря вращению молекулярной машины фермента молекулы АДФ и неорганического фосфата подводятся друг к другу в оптимальной конфигурации, преодолевается энергетический барьер химической реакции синтеза АТФ и тем самым осуществляется требующее затрат энергии фосфорилирование АДФ.
Работа ЭТЦ и АТФ-синтазы тесно связаны друг с другом. При блокировании переноса электронов по ЭТЦ образование АТФ приостанавливается («батарейка» разряжается). Верно и обратное: подавление АТФ-синтазы блокирует работу ЭТЦ и переход электронов по её белкам. Это объясняется тем, что АТФ-синтаза, синтезируя АТФ, возвращает в матрикс протоны, накачанные в межмембранное пространство белками ЭТЦ за счёт особого канала в ферменте. Если же его заблокировать, то белки ЭТЦ будут накачивать протоны в межмембранное пространство до тех пор, пока электрохимический градиент не станет настолько большим, что остановит дальнейший перенос протонов. «Электрическая цепь» размыкается, движение электронов прекращается, и реакции в системе останавливаются.
Две составляющих электрохимического потенциала — электрический мембранный потенциал и химический потенциал — вносят разный вклад в энергообеспечение синтеза АТФ. В митохондриях большая часть синтезируемой АТФ образуется за счёт разности потенциалов, а у алкалифильных бактерий часть электрической энергии даже идёт на компенсацию внешнего pH (отрицательный заряд бактерии помогает отталкивать гидроксильные ионы). В хлоропластах, напротив, больший вклад в синтез АТФ вносит ΔpH, хотя и там тоже есть небольшой мембранный потенциал, который необходим для синтеза АТФ. У фузобактерии Propionigenium modestum[en] он вызывает противонаправленное вращение субъединиц а и с в мембранном FO-домене АТФ-синтазы. Из этих данных следует, что электрический потенциал так же важен для синтеза АТФ, как и химический потенциал.
По сравнению с брожением, окислительное фосфорилирование даёт существенно больший энергетический выход. При гликолизе суммарный выход АТФ составляет всего 2 молекулы, однако в ходе окислительного фосфорилирования синтезируется от 30 до 36 молекул АТФ за счёт 10 НАДН и 2 молекул сукцината, образовавшихся при окислении одной молекулы глюкозы до углекислого газа и воды, в то время как β-окисление жирных кислот даёт около 14 молекул АТФ. Следует учитывать, что выше представлены теоретические, максимально возможные значения выхода АТФ. В действительности же некоторые протоны просачиваются сквозь мембрану, минуя АТФ-синтазу, что снижает выход АТФ.
В отличие от нормальных дифференцированных клеток, у которых основным источником энергии служит окислительное фосфорилирование, раковые клетки преимущественно полагаются на аэробный гликолиз. Этот феномен получил название эффекта Варбурга. По-видимому, для раковых и других быстро пролиферирующих клеток, нуждающихся в быстром увеличении биомассы, более быстрый гликолиз оказывается выгоднее трудоёмкого окислительного фосфорилирования[9]. Такая отличительная особенность раковых клеток (увеличенные по сравнению с нормальными клетками темпы гликолиза) позволяет определять местоположение раковой опухоли в теле при помощи позитронно-эмиссионной томографии.
Многие катаболические процессы, в частности, гликолиз, цикл трикарбоновых кислот и β-окисление, сопровождаются восстановлением кофермента НАДH. Содержащиеся в нём электроны имеют высокий потенциал переноса, иными словами, при окислении они высвобождают большое количество энергии. Однако клетка не извлекает из них всю энергию единовременно — такая реакция была бы неконтролируемой. Вместо этого электроны отрываются от НАДH и доходят до кислорода через серию ферментов, при этом при переходе на каждый из них выделяется небольшое количество энергии. Эти ферменты, составляющие комплексы I—IV ЭТЦ, расположены на внутренней митохондриальной мембране. В ЭТЦ также окисляется сукцинат, однако он включается в окислительное фосфорилирование в другой точке.
У эукариот ферменты этой электрон-транспортной системы используют энергию, выделяющуюся при окислении НАДН, для «накачивания» протонов через внутреннюю митохондриальную мембрану в межмембранное пространство. Накопление протонов в межмембранном пространстве создаёт электрохимический градиент, и заключённая в нём энергия далее используется АТФ-синтазой для синтеза АТФ. Окислительное фосфорилирование в митохондриях эукариот изучено наиболее хорошо. Митохондрии имеются у практически всех эукариот, исключение составляет анаэробное простейшее Trichomonas vaginalis, которое вместо окислительного фосфорилирования осуществляет восстановление протонов до водорода в видоизменённых митохондриях — гидрогеносомах.
Ниже охарактеризованы наиболее типичные дыхательные ферменты и субстраты эукариот. Стандартный электродный потенциал показывает, сколько энергии выделяется при окислении или восстановлении данного вещества, причём восстановители имеют отрицательный потенциал, а окислители — положительный.
НАДН-убихинон-оксидоредуктаза, также известная как НАДН-дегидрогеназа или комплекс I, является первым белком ЭТЦ. Комплекс I представляет собой очень крупный фермент: у млекопитающих он состоит из 46 субъединиц и имеет молекулярную массу свыше 1000 килодальтон (кДа). Детально структура этого комплекса изучена лишь у бактерий; у более сложных организмов он, по-видимому, по внешнему виду напоминает сапог с большой выдающейся из мембраны частью. Гены, кодирующие отдельные белки этого комплекса, содержатся и в ядерном геноме, и в митохондриальном геноме, как и у многих других митохондриальных белковых комплексов.
Этот комплекс катализирует окисление НАДН с передачей двух электронов на кофермент Q10, или убихинон (Q):
НАДН + Q + 5H+матрикс → НАД+ + QH2 + 4H+межмембранное пространство Эта реакция, как и работа всей ЭТЦ, начинается с связывания с комплексом молекул НАД с отдачей двух электронов. Электроны поступают в комплекс через простетическую группу, присоединённую к комплексу — флавинмононуклеотид (ФМН). При получении двух электронов ФМН восстанавливается до ФМНH2. После этого электроны проходят через серию железо-серных кластеров (второй тип простетических групп, имеющихся в комплексе). В комплексе I имеются кластеры и типа [2Fe-2S], и типа [4Fe-4S].
Когда электроны проходят через этот комплекс, из матрикса в межмембранное пространство накачивается 4 протона. Конкретный механизм этого неясен, однако, по-видимому, при этом процессе происходят конформационные изменения комплекса I, благодаря которым белок связывает протоны своей частью, обращённой на внутреннюю сторону мембраны, и выпускает их в мембранное пространство. В конце концов электроны проходят через цепочку железо-серных кластеров и попадают на молекулу убихинона, расположенную внутри внутренней мембраны. Восстановление убихинона также приводит к образованию протонного градиента, и при образовании QH2 из матрикса в межмембранное пространство накачиваются ещё два протона.
Сукцинат-убихинон-оксидоредуктаза, также известная как сукцинатдегидрогеназа или комплекс II, является второй точкой поступления электронов в ЭТЦ. Этот фермент необычен тем, что он входит в состав как цикла трикарбоновых кислот, так и ЭТЦ. Комплекс II состоит из четырёх белковых субъединиц и связывает кофактор ФАД. Кроме того, в этом комплексе имеются железо-серные кластеры и гем, которые не участвуют в транспорте электронов на убихинон, однако, по-видимому, играют важную роль в снижении образования активных форм кислорода[32][33]. Комплекс II окисляет сукцинат до фумарата с восстановлением убихинона. Так как эта реакция даёт меньше энергии, чем окисление НАДH, комплекс II не осуществляет перенос протонов через мембрану и не создаёт протонного градиента.
Сукцинат + Q → фумарат + QH2. У некоторых эукариот, например, паразитического червя Ascaris suum, функционирует фермент, схожий с комплексом II — фумаратредуктаза (менахинол: фумарат-оксидоредуктаза, или QFR), которая работает в обратном направлении и окисляет убихинол с восстановлением фумарата. Это позволяет червю выжить в анаэробных условиях толстой кишки и осуществлять анаэробное окислительное фосфорилирование с фумаратом в качестве акцептора электронов[34]. Другая необычная функция комплекса II проявляется у малярийного плазмодия Plasmodium falciparum. Здесь комплекс II функционирует как оксидаза и регенерирует убихинон, который паразит использует в необычном пути синтеза пиримидинов.
(Электронпереносящий флавопротеин)-оксидоредуктаза (ETF-Q-оксидоредуктаза), является третьей точкой поступления электронов в ЭТЦ. Этот фермент забирает электроны с электронопереносящих флавопротеинов митохондриального матрикса и использует их для восстановления убихинона. Он связывает β-окисление жирных кислот и прочие процессы с окислительным фосфорилированием. Множество ацетил-СоА-дегидрогеназ осуществляют окисление разных субстратов (например, жирных кислот), перенося электроны на электронпереносящий флавопротеин (ETF). ETF-дегидрогеназа в свою очередь окисляет этот белок и переносит электроны на растворённый во внутренней мембране митохондрий убихинон, восстанавливая его до убихинола, который затем поступает в дыхательную цепь переноса электронов. ETF-Q-оксидоредуктаза содержит флавин и железо-серный кластер типа [4Fe-4S], но, в отличие от других дыхательных комплексов, она прикрепляется к поверхности мембраны и не пересекает липидный бислой.
ETFвосстановленный + Q → ETFокисленный + QH2. У млекопитающих этот фермент играет важную роль в β-окислении жирных кислот, катаболизме аминокислот и холина. У растений ETF-Q-оксидоредуктаза важна для выживания во время длительного периода темноты.
Цитохром-bc1-комплекс также известен как убихинол-цитохром c-оксидоредуктаза, или просто комплекс III. У млекопитающих этот фермент является димером, и каждая субъединица комплекса состоит из 11 белковых субъединиц, один железо-серный кластер [2Fe-2S] и три цитохрома: один цитохром с1 и два цитохрома b. Цитохромы — это электронотранспортные белки, содержащие по крайней мере одну гемовую группу. По мере продвижения электронов по белку атомы железа в гемах переходят из восстановленного состояния (Fe2+) в окисленное (Fe3+).
Комплекс III катализирует реакцию окисления одной молекулы убихинона и восстановления двух молекул цитохрома c — гемсодержащего белка, свободно перемещающегося в митохондрии. В отличие от кофермента Q, который может переносить два электрона, цитохром c переносит только один электрон.
QH2 + 2 цитохром сокисленный + 2H+матрикс → Q + 2 цитохром свосстановленный + 4H+межмембранное пространство Механизм реакции комплекса III более сложен, чем у остальных комплексов, и протекает в два этапа, составляющих так называемый Q-цикл[en][45]. На первом этапе фермент связывает один восстановленный убихинон, один окисленный убихинон и один цитохром c, первый из которых — QH2 — окисляется, и один электрон переходит с него на цитохром c. Два протона, высвобождаемые QH2, уходят в межмембранное пространство. Третьим субстратом является убихинон, который связывает второй электрон с QH2 и превращается в Q- — семихинон-радикал. Первые два субстрата покидают фермент, однако промежуточный убисемихинон остаётся связанным с ним. На втором этапе цикла происходит связывание второй молекулы QH2, которая отдаёт один свой электрон ещё одной молекуле цитохрома c, а 2 протона уходят в межмембранное пространство. Второй электрон переходит на семихинон-радикал и восстанавливает его до QH2, при этом из митохондриального матрикса берутся два протона. Этот восстановленный QH2 покидает фермент.
Убихинон восстанавливается на внутренней стороны мембраны и окисляется на другой, при этом происходит перенос протонов через мембрану, что создаёт протонный градиент. Двухэтапный механизм реакции, осуществляемой комплексом III, очень важен, так как он увеличивает эффективность переноса протонов. Если бы вместо Q-цикла одна молекула QH2 непосредственно отдавала свои два электрона двум молекулам цитохрома c, то эффективность была бы вполовину меньше, потому что переносился бы только один протон вместо двух на одну восстановленную молекулу цитохрома с.
Цитохром с-оксидаза, также называемая комплекс IV, является последним белковым комплексом ЭТЦ. У млекопитающих этот фермент имеет чрезвычайно сложную структуру и содержит 13 субъединиц, две гемовые группы, а также два атома меди, связанные остатками гистидина, метионина и глутамата. Помимо этого он взаимодействует с одним атомом магния и одним атомом цинка.
Комплекс IV осуществляет последнюю реакцию ЭТЦ и переносит электроны на кислород, а также накачивает 4 протона из матрикса в межмембранное пространство. При этом конечный акцептор электронов — кислород — восстанавливается до воды. Накачивание протонов и потребление протонов матрикса для восстановления кислорода до воды создают протонный градиент. В общем, комплекс IV катализирует реакцию окисления цитохрома c и восстановления кислорода:
Многие эукариотические организмы имеют ЭТЦ, отличные от описанной выше, которая характерна для млекопитающих. Например, у растений имеются альтернативные НАДH-редуктазы, которые окисляют НАДH в цитозоле, а не в митохондриях, и переносят эти электроны непосредственно на убихиноны. Эти ферменты не перекачивают протоны, поэтому они восстанавливают убихинон без изменения электрохимического градиента митохондриальной мембраны[52]. У растений, а также некоторых грибов, протистов и, возможно, некоторых животных имеется альтернативная оксидаза, переносящая электроны непосредственно с убихинола на кислород.
Механизмы транспорта электронов, в которых задействованы эти альтернативные НАДН-редуктазы и оксидазы, имеют меньший выход АТФ по сравнению с полной ЭТЦ. Преимущества такого укорочения пути переноса электронов не в полной мере ясны. Однако известно, что альтернативная оксидаза образуется в ответ на стрессовые условия: холод, образование активных форм кислорода, инфекции и другие, которые подавляют работу полной ЭТЦ. Поэтому альтернативные механизмы могут повышать устойчивость организма к неблагоприятным воздействиям, уменьшая окислительный стресс.
Согласно первоначальной модели ЭТЦ, дыхательные комплексы располагаются в митохондриальной мембране свободно и независимо друг от друга. Тем не менее современные данные показывают, что дыхательные комплексы формируют суперкомплексы более высокого порядка — респирасомы. Согласно этой модели, дыхательные комплексы организованы в набор взаимодействующих друг с другом ферментов. Эти взаимодействия дают возможность для обмена субстратами между различными ферментными комплексами, что увеличивает скорость и эффективность переноса электронов. В суперкомплексах млекопитающих некоторые компоненты присутствуют в большем числе, чем другие, и, согласно некоторым данным, отношение между количеством комплексов I/II/III/IV и АТФ-синтазы составляет примерно 1:1:3:7:4. Однако споры относительно справедливости такой модели не утихают, и некоторые данные не согласуются с ней.
При окислительном фосфорилировании происходит перенос электронов от соединений-доноров к соединениям-акцепторам в ходе окислительно-восстановительных реакций. В ходе этих реакций выделяется энергия, которая далее запасается в виде АТФ. У эукариот эти окислительно-восстановительные реакции осуществляются несколькими белковыми комплексами, локализованными во внутренней митохондриальной мембране, а у прокариот они располагаются в межмембранном пространстве[en] клетки. Этот набор связанных белков составляет электрон-транспортную цепь (ЭТЦ). У эукариот в состав ЭТЦ входит пять белковых комплексов, в то время как у прокариот её составляют множество различных белков, работающих с различными донорами и акцепторами электронов.
Энергия, выделяющаяся при движении электронов по ЭТЦ, используется для перекачки протонов из митохондриального матрикса через внутреннюю мембрану в межмембранное пространство. При этом увеличивается электрохимический градиент, то есть возрастает разность концентраций протонов и разность электрических потенциалов по обе стороны внутренней мембраны, и тем самым накапливается энергия, которая высвобождается при возвращении протонов в матрикс. Обратно в матрикс протоны проходят через особый белковый комплекс — АТФ-синтазу; сам процесс перемещения протонов по их электрохимическому градиенту получил название хемиосмос. АТФ-синтаза использует выделяющуюся при хемиосмосе энергию для синтеза АТФ из АДФ в реакции фосфорилирования. Эта реакция запускается при вращении части АТФ-синтазы, которое поддерживается благодаря потоку протонов: таким образом, АТФ-синтаза работает как вращающийся молекулярный мотор.
Хотя окислительное фосфорилирование обеспечивает энергией клетки и поддерживает жизнь клеток, в ходе этого процесса также образуются активные формы кислорода, в частности, супероксид и пероксид водорода. Они способствуют образованию в клетках свободных радикалов, которые разрушают белки и причиняют вред клеткам, приводя к болезням и старению. Ферменты окислительного фосфорилирования являются мишенями для многих биологически активных веществ и ядов, которые подавляют их активность.
Окислительное фосфорилирование следует отличать от субстратного фосфорилирования, при котором АТФ синтезируется не за счёт энергии переноса электронов и протонов по цепи переносчиков, а при фосфорилировании АДФ до АТФ при отрыве фосфата от соединений с высоким потенциалом переноса фосфата.
Запасённая при переносе протонов энергия используется для работы АТФ-синтазы. Протоны перемещаются по электрохимическому градиенту обратно на N-сторону мембраны, запуская вращение некоторых частей молекулы фермента. Благодаря вращению молекулярной машины фермента молекулы АДФ и неорганического фосфата подводятся друг к другу в оптимальной конфигурации, преодолевается энергетический барьер химической реакции синтеза АТФ и тем самым осуществляется требующее затрат энергии фосфорилирование АДФ.
Работа ЭТЦ и АТФ-синтазы тесно связаны друг с другом. При блокировании переноса электронов по ЭТЦ образование АТФ приостанавливается («батарейка» разряжается). Верно и обратное: подавление АТФ-синтазы блокирует работу ЭТЦ и переход электронов по её белкам. Это объясняется тем, что АТФ-синтаза, синтезируя АТФ, возвращает в матрикс протоны, накачанные в межмембранное пространство белками ЭТЦ за счёт особого канала в ферменте. Если же его заблокировать, то белки ЭТЦ будут накачивать протоны в межмембранное пространство до тех пор, пока электрохимический градиент не станет настолько большим, что остановит дальнейший перенос протонов. «Электрическая цепь» размыкается, движение электронов прекращается, и реакции в системе останавливаются.
Две составляющих электрохимического потенциала — электрический мембранный потенциал и химический потенциал — вносят разный вклад в энергообеспечение синтеза АТФ. В митохондриях большая часть синтезируемой АТФ образуется за счёт разности потенциалов, а у алкалифильных бактерий часть электрической энергии даже идёт на компенсацию внешнего pH (отрицательный заряд бактерии помогает отталкивать гидроксильные ионы). В хлоропластах, напротив, больший вклад в синтез АТФ вносит ΔpH, хотя и там тоже есть небольшой мембранный потенциал, который необходим для синтеза АТФ. У фузобактерии Propionigenium modestum[en] он вызывает противонаправленное вращение субъединиц а и с в мембранном FO-домене АТФ-синтазы. Из этих данных следует, что электрический потенциал так же важен для синтеза АТФ, как и химический потенциал.
По сравнению с брожением, окислительное фосфорилирование даёт существенно больший энергетический выход. При гликолизе суммарный выход АТФ составляет всего 2 молекулы, однако в ходе окислительного фосфорилирования синтезируется от 30 до 36 молекул АТФ за счёт 10 НАДН и 2 молекул сукцината, образовавшихся при окислении одной молекулы глюкозы до углекислого газа и воды, в то время как β-окисление жирных кислот даёт около 14 молекул АТФ. Следует учитывать, что выше представлены теоретические, максимально возможные значения выхода АТФ. В действительности же некоторые протоны просачиваются сквозь мембрану, минуя АТФ-синтазу, что снижает выход АТФ.
В отличие от нормальных дифференцированных клеток, у которых основным источником энергии служит окислительное фосфорилирование, раковые клетки преимущественно полагаются на аэробный гликолиз. Этот феномен получил название эффекта Варбурга. По-видимому, для раковых и других быстро пролиферирующих клеток, нуждающихся в быстром увеличении биомассы, более быстрый гликолиз оказывается выгоднее трудоёмкого окислительного фосфорилирования[9]. Такая отличительная особенность раковых клеток (увеличенные по сравнению с нормальными клетками темпы гликолиза) позволяет определять местоположение раковой опухоли в теле при помощи позитронно-эмиссионной томографии.
У эукариот ферменты этой электрон-транспортной системы используют энергию, выделяющуюся при окислении НАДН, для «накачивания» протонов через внутреннюю митохондриальную мембрану в межмембранное пространство. Накопление протонов в межмембранном пространстве создаёт электрохимический градиент, и заключённая в нём энергия далее используется АТФ-синтазой для синтеза АТФ. Окислительное фосфорилирование в митохондриях эукариот изучено наиболее хорошо. Митохондрии имеются у практически всех эукариот, исключение составляет анаэробное простейшее Trichomonas vaginalis, которое вместо окислительного фосфорилирования осуществляет восстановление протонов до водорода в видоизменённых митохондриях — гидрогеносомах.
Ниже охарактеризованы наиболее типичные дыхательные ферменты и субстраты эукариот. Стандартный электродный потенциал показывает, сколько энергии выделяется при окислении или восстановлении данного вещества, причём восстановители имеют отрицательный потенциал, а окислители — положительный.
Этот комплекс катализирует окисление НАДН с передачей двух электронов на кофермент Q10, или убихинон (Q):
НАДН + Q + 5H+матрикс → НАД+ + QH2 + 4H+межмембранное пространство
Эта реакция, как и работа всей ЭТЦ, начинается с связывания с комплексом молекул НАД с отдачей двух электронов. Электроны поступают в комплекс через простетическую группу, присоединённую к комплексу — флавинмононуклеотид (ФМН). При получении двух электронов ФМН восстанавливается до ФМНH2. После этого электроны проходят через серию железо-серных кластеров (второй тип простетических групп, имеющихся в комплексе). В комплексе I имеются кластеры и типа [2Fe-2S], и типа [4Fe-4S].
Когда электроны проходят через этот комплекс, из матрикса в межмембранное пространство накачивается 4 протона. Конкретный механизм этого неясен, однако, по-видимому, при этом процессе происходят конформационные изменения комплекса I, благодаря которым белок связывает протоны своей частью, обращённой на внутреннюю сторону мембраны, и выпускает их в мембранное пространство. В конце концов электроны проходят через цепочку железо-серных кластеров и попадают на молекулу убихинона, расположенную внутри внутренней мембраны. Восстановление убихинона также приводит к образованию протонного градиента, и при образовании QH2 из матрикса в межмембранное пространство накачиваются ещё два протона.
Сукцинат + Q → фумарат + QH2.
У некоторых эукариот, например, паразитического червя Ascaris suum, функционирует фермент, схожий с комплексом II — фумаратредуктаза (менахинол: фумарат-оксидоредуктаза, или QFR), которая работает в обратном направлении и окисляет убихинол с восстановлением фумарата. Это позволяет червю выжить в анаэробных условиях толстой кишки и осуществлять анаэробное окислительное фосфорилирование с фумаратом в качестве акцептора электронов[34]. Другая необычная функция комплекса II проявляется у малярийного плазмодия Plasmodium falciparum. Здесь комплекс II функционирует как оксидаза и регенерирует убихинон, который паразит использует в необычном пути синтеза пиримидинов.
ETFвосстановленный + Q → ETFокисленный + QH2.
У млекопитающих этот фермент играет важную роль в β-окислении жирных кислот, катаболизме аминокислот и холина. У растений ETF-Q-оксидоредуктаза важна для выживания во время длительного периода темноты.
Комплекс III катализирует реакцию окисления одной молекулы убихинона и восстановления двух молекул цитохрома c — гемсодержащего белка, свободно перемещающегося в митохондрии. В отличие от кофермента Q, который может переносить два электрона, цитохром c переносит только один электрон.
QH2 + 2 цитохром сокисленный + 2H+матрикс → Q + 2 цитохром свосстановленный + 4H+межмембранное пространство
Механизм реакции комплекса III более сложен, чем у остальных комплексов, и протекает в два этапа, составляющих так называемый Q-цикл[en][45]. На первом этапе фермент связывает один восстановленный убихинон, один окисленный убихинон и один цитохром c, первый из которых — QH2 — окисляется, и один электрон переходит с него на цитохром c. Два протона, высвобождаемые QH2, уходят в межмембранное пространство. Третьим субстратом является убихинон, который связывает второй электрон с QH2 и превращается в Q- — семихинон-радикал. Первые два субстрата покидают фермент, однако промежуточный убисемихинон остаётся связанным с ним. На втором этапе цикла происходит связывание второй молекулы QH2, которая отдаёт один свой электрон ещё одной молекуле цитохрома c, а 2 протона уходят в межмембранное пространство. Второй электрон переходит на семихинон-радикал и восстанавливает его до QH2, при этом из митохондриального матрикса берутся два протона. Этот восстановленный QH2 покидает фермент.
Убихинон восстанавливается на внутренней стороны мембраны и окисляется на другой, при этом происходит перенос протонов через мембрану, что создаёт протонный градиент. Двухэтапный механизм реакции, осуществляемой комплексом III, очень важен, так как он увеличивает эффективность переноса протонов. Если бы вместо Q-цикла одна молекула QH2 непосредственно отдавала свои два электрона двум молекулам цитохрома c, то эффективность была бы вполовину меньше, потому что переносился бы только один протон вместо двух на одну восстановленную молекулу цитохрома с.
Комплекс IV осуществляет последнюю реакцию ЭТЦ и переносит электроны на кислород, а также накачивает 4 протона из матрикса в межмембранное пространство. При этом конечный акцептор электронов — кислород — восстанавливается до воды. Накачивание протонов и потребление протонов матрикса для восстановления кислорода до воды создают протонный градиент. В общем, комплекс IV катализирует реакцию окисления цитохрома c и восстановления кислорода:
4 Цитохром свосстановленный + О2 + 8H+ → 4 Цитохром сокисленный + 2Н2О + 4Н+.
Механизмы транспорта электронов, в которых задействованы эти альтернативные НАДН-редуктазы и оксидазы, имеют меньший выход АТФ по сравнению с полной ЭТЦ. Преимущества такого укорочения пути переноса электронов не в полной мере ясны. Однако известно, что альтернативная оксидаза образуется в ответ на стрессовые условия: холод, образование активных форм кислорода, инфекции и другие, которые подавляют работу полной ЭТЦ. Поэтому альтернативные механизмы могут повышать устойчивость организма к неблагоприятным воздействиям, уменьшая окислительный стресс.